蛋白质组学结合生物学手段解析13-3-3ε相互作用复合物的研究

【摘要】14-3-3蛋白质家族是一个在真核生物中广泛表达的28-33kDa的酸性蛋白质。从酵母到哺乳动物细胞都有14-3-3蛋白质的表达,并且结构和功能非常保守。在哺乳动物中有7个14-3-3亚型(isoform),分别是β、γ、δ、η、σT和ζ,各个亚型由不同的基因编码。目前已报道有超过100个蛋白质与14-3-3相互作用,这些与14-3-3相互作用的蛋白质涉及到的生物学功能包括细胞周期调控、信号转导、应激响应、细胞凋亡、基因转录调控、细胞代谢和参与维持细胞骨架的完整性等。14-3-3能与如此之多的蛋白质相互作用依赖于其特异性的磷酸化丝氨酸/苏氨酸底物结合活性。14-3-3与底物结合能改变底物(酶)催化活性、影响底物的细胞定位、介导特定蛋白质复合物形成或者导致底物对蛋白酶或磷酸酶更为敏感等。14-3-3能结合和调节很多癌基因表达产物和肿瘤抑制基因的表达产物,暗示了14-3-3蛋白在癌症中的潜在重要作用。尽管如此,到目前为止,并没有发现14-3-3具有独特的催化能力,其参与到肿瘤发生和发展过程中似乎是依赖于其接头蛋白(adaptorprotein)的功能。正常细胞转变为恶性的肿瘤细胞是一个多步骤的过程。该过程包括细胞获得不受调控的增殖能力、能逃避免疫系统监控的能力、抵抗细胞凋亡的能力和获得侵袭和迁移的能力。因此,对于众多类型的癌细胞而言,细胞功能变异的积累使得癌细胞在原发性肿瘤的基础获得了侵袭和迁移的能力。14-3-3蛋白几乎参与到肿瘤发生和发展的每一步过程中。比如14-3-3与癌基因表达产物Raf、Bcr和Bcr-Abl相互作用调控细胞增殖；14-3-3与Bad、Bax和ASK-1相互作用调节细胞存活与细胞凋亡；14-3-3与Foxo相互作用调节基因转录；14-3-3与肿瘤抑制基因产物TSC2、p27等相互作用参与抑制肿瘤生长；14-3-3与细胞周期调控蛋白CDC25、Weel和CHK1等相互作用参与细胞周期的调控；14-3-3与integrins和Ron等相互作用调节细胞的运动和迁移。总体而言,14-3-3正调控细胞生长和促进细胞存活,负调诱导细胞死亡或细胞衰老的过程。使得14-3-3蛋白有促进癌症发生和发展潜能。但是也有很多报道显示在DNA损伤时,14-3-3能使细胞周期进程延滞,暗示了其肿瘤抑制活性。肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一。我国人口的10%左右是乙肝患者或乙肝病毒携带者,肝病防治任重道远。目前对肝癌的发生、发展的机制仍有很多谜团无法解答。鉴于14-3-3蛋白与肿瘤发生与发展的密切关系,我们就选取了14-3-3家族中最保守的成员epsilon(ε)亚型,通过筛选在肝癌细胞株QGY-7703成功获得了稳定表带有FLAG标签的14-3-3￡稳转株。我们以该细胞为材料,利用稳定同位素标记和生物质谱为基础的定量蛋白质组学策略,定性和定量研究了在天然状态和在博莱霉素(bleomycin,BLM)诱导DNA损伤状态下,14-3-3e在肝癌细胞中的相互作用状况。希望通过本实验能够深入地解析14-3-3￡的相互作用分子状况,找出一些有可能参与到肝癌恶化转移的分子,为肝癌的临床治疗提供可能的靶位。论文的研究工作主要包括四个部分,分述如下：(一)不同细胞对博莱霉素应答状况研究博莱霉素(bleomycin,BLM)是一种非常重要的临床化疗药物,其对睾丸癌和一些特定类型的淋巴瘤有很好的疗效。BLM发挥化疗的机理是能够造成DNA单链断裂(DNAsingle-strandbreak,SSB)和DNA双链断裂(DNAdouble-strandbreak,DSB),DSB是BLM诱导的主要产物。BLM造成的大量DSB损伤最终诱导细胞凋亡或坏死,从而达到杀伤癌细胞的目的。BLM诱导细胞产生的DSB损伤能激活DSB应答机制。参与DSB应答的网络及其复杂。为了更好的了解细胞对BLM诱导的DSB损伤应答机制,我们用优化好的BLM剂量对不同细胞进行时间梯度刺激,通过检测一些潜在的应答DSB损伤的信号分子的活化程度来寻找合适的DSB损伤应答分子标志物(biomarker)。我们的实验表明,H2AX和CHK1的活化程度对BLM的刺激是时间依赖性的。H2AX的磷酸化是目前公认的山电离辐射造成的DSB损伤应答分子标志物,CHK1也是目前公认的SSB损伤应答的分子标志物。BLM在细胞中能同时造成SSB和DSB,并且二者的损伤程度与BLM的刺激时间成正相关。因此,H2AX和CHK1可做为应答BLM诱导的DSB损伤分子标志物。与此同时,我们的实验也表明ERK1/2的活化和IκB的降解在不同细胞中有明显差异,这说明由BLM诱导细胞MAPKs的活化具有细胞特异性。我们的实验第一次比较系统地研究了不同细胞对BLM诱导的DNA损伤应答状况,找到了能用于研究BLM诱导DNA损伤的分子标志物(H2AX和CHKl),能够为相关研究提供数据支持,同时也为我们的后续实验优化了条件。(二)定量蛋白质组学解析肝癌细胞在博莱霉素诱导DNA损伤状况下,14-3-3￡相互作用复合物的研究DNA损伤修复失败或修复通路缺陷是肿瘤发生的重要因素。博莱霉素(bleomycin,BLM)是一种抗肿瘤药物。BLM能通过诱导DNA双链断裂(DNAdouble-strandbreak,DSB)而达到杀伤癌细胞的目的。BLM在癌细胞中诱导产生的DSB损伤会激活DSB损伤应答通路,以促进DSB损伤修复。DSB损伤应答包括细胞感知DSB损伤、诱导细胞周期进程阻滞和激活DSB修复通路。在DSB损伤应答过程中,蛋白质后修饰介导的信号传递广泛而精密,其中磷酸化修饰发挥着主要作用。而14-3-3的底物几乎都是磷酸化的蛋白质。因此有理由认为14-3-3在应对DSB损伤应答过程中很可能发挥着重要功能。基于此,我们选取了14-3-3家族中最保守的成员epsilon(ε)亚型,通过稳定同位素体内代谢标记(AACT/SILAC)结合免疫共沉淀、高效液相色谱和高分辨率质谱等实验方法完成了在BLM诱导DSB损伤条件下14-3-3ε相互作用复合物的鉴定和定量工作。通过数据分析,我们找到了30多个新的与14-3-3ε相互作用的分子。通过免疫沉淀结合免疫印迹,我们对鉴定到的一些分子(NONO、HDAC1、HDAC6.DDB和TAB1)进行了验证,其结果与质谱的定量信息是一致的。这些被验证的蛋白质参与到蛋白质代谢过程、蛋白质翻译调控、蛋白质磷酸化、泛素化修饰过程、蛋白质激酶信号通路、RNA加工过程和蛋白质核质转运等生理过程中。进一步体现和印证了14-3-3￡所参与的生物学功能广泛性。基于方法学和数据的可靠性的基础上,我们进一步聚焦到一个非常感兴趣的蛋白质分子TAK1上。质谱和后续的免疫印迹都证明了TAK1是BLM诱导的14-3-3￡特异性相互作用分子。我们通过突变实验证明14-3-3ε是与TAK1的激酶结构域(kinasedomain)相互作用的。功能实验表明14-3-3￡与TAK1相互作用能起到维持TAK1处于活化状态的功能,从而实现TAK1的抗BLM诱导的细胞凋亡过程,促进细胞存活。通过以上的实验数据表明：1、我们的以稳定同位素标记为基础的定量蛋白质组学方法的可行性和精确性；2、第一次系统地研究和揭示了14-3-3ε在DNA损伤应答过程中广泛而重要的作用。通过我们的结果很有可能为肝癌的治疗提供潜在的作用靶位。(三)、BLM诱导DNA损伤状况下,MVP与14-3-3￡相互作用的生物学功能研究vault颗粒(vaultparticle)是目前在真核细胞中发现的最大的核糖核蛋白复合物。vault颗粒由至少一个不翻译的RNA分子和MVP、PARP4和TEP1三种蛋白组装而成的一个结构独特的“胶囊“状结构。其中MVP占到vault颗粒总量的70%以上。MVP几乎与其他蛋白没有同源性,但其本身在进化却极为保守。MVP/vault颗粒结构奇特、进化保守,理应发挥保守而重要的生物学功能。但是,遗憾的是到目前为止,我们对这个巨型分子的功能却知之甚少,研究进展极为缓慢。我们利用免疫沉淀结合生物质谱研究在BLM诱导DNA损伤状况下,14-3-3￡相互作用复合物时,非常意外地鉴定到了vault颗粒的所有组成成分,包括MVP,PARP4和TEP1。其中MVP蛋白的质谱鉴定得分很高,总共有二十多条肽段匹配到MVP蛋白上。这引起了我们极大地兴趣,吸引我们去挖掘MVP/vault颗粒与14-3-3e的关系。我们通过实验首先确证了MVP是BLM诱导的14-3-3ε特异性相互作用蛋白质；其次,我们在MVP上找到了介导其与14-3-3ε相互作用的磷酸化位点。最后我们通过生物学功能分析表明了MVP/vault颗粒有抗BLM诱导DNA损伤的功能,而14-3-3ε则有抑制MVP/vault颗粒促进BLM诱导DNA损伤的作用。我们同时将实验扩展到了其他表达MVP/vault颗粒的细胞中,也观察到了同样的现象。这说明MVP/vault颗粒与14-3-3ε的相互作用是一个普遍的现象。通过我们的实验很有可能为临床化疗提供药物靶位。(四)、肝癌细胞中14-3-3ε天然复合物状况研究肝癌细胞是一种恶性肿瘤细胞。正常细胞转变为恶性的肿瘤细胞是一个多步骤的过程。该过程包括细胞获得不受调控的增殖能力、能逃避免疫系统监控的能力、抵抗细胞凋亡的能力和获得侵袭和迁移的能力。14-3-3蛋白质几乎参与到肿瘤发生与发展的每一步过程。为了了解14-3-3ε在天然状态下,其在肝癌细胞中的相互作用状况。我们利用稳定同位标记(AACT/SILAC)为基础的定量蛋白质学研究策略,定性和定量研究了天然状态下,肝癌细胞QGY-7703中14-3-3ε相互作用复合物状况。通过数据分析,我们找到了36个与14-3-3ε特异性相互作用的蛋白质。为了验证我们方法的可靠性,我们通过免疫沉淀和免疫印迹确认了14-3-3ζ是14-3-3ε特异性相互作用分子,这与质谱的定量结果相一致；其次,通过对这些分子进行生物学功能分类分析,我们发现这些分子参与到蛋白质的细胞定位、蛋白质转运、细胞运动、参与细胞凋亡/死亡过程、细胞骨架组织和细胞粘连等生理过程中。细胞转移能力和抗凋亡的能力是恶性肿瘤的重要特征。细胞转移依赖于细胞骨架的变化,恶性肿瘤为了生存演化出了抗细胞凋亡或死亡的能力。在鉴定到的14-3-3ε相互作用分子中,很多蛋白质参与到细胞运动、细胞骨架组织和调节细胞凋亡/死亡的生理过程中。我们实验结果进一步加强了和印证了14-3-3ε在癌症发生与发展中的重要作用。希望通过我们的实验结果能为更好的了解肝癌细胞的发生和发展提供实验支撑,同时也有可能为临床检测和治疗提供分子标志物和给药靶位。
【作者】唐思伟；
【导师】陈先；
【作者基本信息】复旦大学，疾病蛋白质组学，2010，博士
【关键词】DNA双链断裂；蛋白质相互作用；稳定同位素体内标记；稳定细胞系；免疫共沉淀；分子克隆与突变；

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